Sắc kí cột là gì? Các bài báo nghiên cứu khoa học liên quan

Định nghĩa sắc kí cột

Sắc kí cột (column chromatography) là kỹ thuật phân tách và phân lập các thành phần trong hỗn hợp dựa trên sự khác biệt về tương tác hóa lý giữa các phân tử với pha tĩnh và pha động. Pha tĩnh thường được đóng gói trong cột thủy tinh hoặc thép không gỉ, còn pha động di chuyển theo hướng trọng lực hoặc áp suất để mang các thành phần mẫu đi qua cột.

Mỗi thành phần trong hỗn hợp di chuyển với tốc độ khác nhau tùy vào ái lực với pha tĩnh; thành phần tương tác yếu sẽ elu nhanh hơn, trong khi thành phần tương tác mạnh bị giữ lại lâu hơn. Nhờ vậy, khi thu nhận eluate theo từng giọt hoặc từng phần thể tích, có thể thu được các phân đoạn chứa thành phần gần như tinh khiết.

Ứng dụng của sắc kí cột rất rộng, từ phân tích dược phẩm, hóa sinh, đến tổng hợp hữu cơ và nghiên cứu tự nhiên. Phương pháp này cho phép thu nhận mẫu với độ tinh khiết cao, hỗ trợ các bước phân tích tiếp theo như phổ khối (MS) hoặc phổ hồng ngoại (IR).

Nguyên lý cơ bản

Quá trình phân tách trong sắc kí cột dựa trên hai pha chính:

• Pha tĩnh: là môi trường rắn hoặc gel (silica gel, alumina, polymer) được nhồi kín bên trong cột, có nhiệm vụ giữ lại các phân tử dựa trên các tương tác vật lý và hóa học như liên kết hydro, tương tác Van der Waals, và tương tác tĩnh điện.
• Pha động: là dung môi đơn chất hoặc hỗn hợp dung môi (hexane, ethyl acetate, methanol, acetonitrile…) chảy qua cột mang mẫu qua pha tĩnh. Thành phần pha động có thể thay đổi độ phân cực theo thời gian (gradient) để tối ưu độ phân tách.

Khi hỗn hợp mẫu được đưa vào đầu cột, mỗi thành phần sẽ tiếp xúc lặp lại với pha tĩnh và pha động. Phương trình cân bằng phân phối mô tả tỉ lệ nồng độ của chất trên pha tĩnh và pha động tại mỗi điểm trong cột. Sự khác biệt về hằng số phân phối này quyết định độ giữ lại (retention) và độ phân giải (resolution) giữa các đỉnh elu.

Thiết bị và vật liệu

Cột sắc kí thường làm từ thủy tinh trong suốt (cho sắc kí áp suất thấp) hoặc thép không gỉ (HPLC) để chịu được áp suất cao. Kích thước cột thay đổi đa dạng tùy vào mục đích:

• Cột preparative: đường kính 1–5 cm, chiều dài 20–50 cm, dùng để thu mẫu gram–kilogram.
• Cột analytical (HPLC): đường kính 2–4.6 mm, chiều dài 50–250 mm, dùng để phân tích định tính–định lượng trace, microgram–milligram.

Loại cột	Đường kính	Chiều dài	Áp suất tối đa
Flash chromatography	1–5 cm	20–40 cm	5–10 bar
HPLC (analytical)	2–4.6 mm	50–250 mm	200–600 bar

Pha tĩnh phổ biến là silica gel có hoạt tính cao (40–63 µm cho flash, 3–10 µm cho HPLC) hoặc alumina, polymer C18 (reverse phase). Pha động được bơm qua cột bằng bơm piston chính xác (HPLC pump) hoặc áp suất khí (flash). Detector UV/Vis, khối phổ (MS) hay khúc xạ kế (RI) được đặt ở đầu ra để theo dõi tín hiệu eluate thời gian thực (Thermo Fisher Scientific).

Pha tĩnh

Pha tĩnh là yếu tố quyết định selectivity và hiệu năng phân tách. Silica gel (SiO₂) có bề mặt nhiều por, nhóm silanol (–Si–OH) cho tương tác hydrogen mạnh với các hợp chất phân cực. Alumina (Al₂O₃) có tính bazơ, thích hợp tách các hợp chất acid yếu.

Functionalization pha tĩnh (C18, NH₂, phenyl) thay đổi tính phân cực và selectivity. Ví dụ, pha đảo ngược C18 (reverse phase) dùng cho hợp chất kị nước, ngược lại pha kích thích (normal phase) dùng cho hợp chất ưa nước.

• Silica gel 60 Å, 40–63 µm: phổ thông, chi phí thấp.
• C18 bonded silica, 3–10 µm: HPLC reverse phase.
• Polymer styrene–divinylbenzene: bền cơ học, tái sử dụng.

Lựa chọn pha tĩnh cần cân nhắc độ ổn định hóa học, áp suất làm việc và khả năng tái sử dụng. Các pha monolithic hoặc core–shell mới gia tăng tốc độ phân tách và độ phân giải cao hơn so với hạt gel truyền thống (ACS Publications).

Pha động

Pha động trong sắc kí cột là dung môi hoặc hỗn hợp dung môi di chuyển qua pha tĩnh, mang theo mẫu để tách các thành phần. Các dung môi phổ biến bao gồm hexane, ethyl acetate, methanol, acetonitrile và các hỗn hợp gradient từ kị nước đến cực phân cực.

Gradient pha động được thiết kế để tối ưu độ phân giải: bắt đầu từ dung môi kém phân cực để loại trừ các thành phần kị nước, sau đó tăng dần tỷ lệ dung môi phân cực nhằm elu các hợp chất phân cực mạnh. Gradient có thể tuyến tính hoặc isocratic tùy mục tiêu phân tách và cấu trúc mẫu.

• Hexane–ethyl acetate: thường dùng cho sắc kí pha bình thường (normal phase).
• Water–acetonitrile hoặc water–methanol: dùng cho sắc kí pha đảo ngược (reverse phase).
• Thêm acid nhẹ (formic, acetic) hoặc base (ammonium hydroxide) để điều chỉnh pH và cải thiện peak shape.

Áp suất dòng pha động được kiểm soát bởi bơm piston (HPLC) hoặc khí nén (flash), ảnh hưởng trực tiếp đến thời gian lưu $t_R$ và độ phân giải. Tốc độ dòng lớn giúp giảm thời gian chạy nhưng có thể làm giảm độ phân giải do giảm thời gian tương tác giữa mẫu và pha tĩnh.

Cơ chế giữ lại và hệ số giữ lại

Cơ chế giữ lại (retention mechanism) mô tả cách mỗi hợp chất tương tác với pha tĩnh và pha động. Trong sắc kí pha thường, tương tác kỵ nước (hydrophobic) chi phối, còn trong pha đảo ngược, tương tác phân cực và hydro bonding đóng vai trò chính.

Hệ số giữ lại (retention factor) được tính bằng công thức:
$k = \frac{t_R - t_0}{t_0}$
trong đó $t_R$ là thời gian lưu và $t_0$ là thời gian lưu của một chất không tương tác (dead time).

Thông số	Ý nghĩa
$t_R$	Thời gian mẫu đi qua cột đến detector
$t_0$	Thời gian lưu của dung môi hoặc chất không tương tác
$k$	Độ mạnh tương tác với pha tĩnh

Số đĩa lý thuyết (theoretical plates) cho biết hiệu quả phân tách:
$N = 16\left(\frac{t_R}{w}\right)^2$
với w là độ rộng đỉnh tại chiều cao 50 % (peak width). Giá trị N càng cao, độ phân giải càng tốt.

Tối ưu hoá quy trình

Tối ưu kích thước hạt pha tĩnh và chiều dài cột để cân bằng giữa áp suất và độ phân giải: hạt nhỏ (3–5 µm) cho HPLC tăng N nhưng đòi hỏi áp suất cao, hạt lớn (40–63 µm) cho flash chromatography chịu áp lực thấp hơn.

Điều chỉnh gradient pha động bằng cách thử nghiệm tỷ lệ dung môi ban đầu, tốc độ tăng gradient và tốc độ dòng giúp xác định điều kiện tối ưu cho từng hỗn hợp mẫu. Việc này thường thực hiện qua nhiều lần chạy thử và phân tích peak shape, thời gian lưu và độ phân lập.

• Thử nghiệm isocratic trước, sau đó phát triển gradient.
• Sử dụng phần mềm tự động hóa (autosampler, gradient optimizer) để rút ngắn thời gian phát triển phương pháp.
• Kiểm soát nhiệt độ cột (column oven) để duy trì độ nhớt dung môi và độ tái tạo kết quả.

Ứng dụng thực tiễn

Sắc kí cột được ứng dụng rộng rãi trong phân tích dược phẩm để tách và định lượng hoạt chất, tạp chất hoặc sản phẩm chuyển hóa. Ví dụ, trong kiểm nghiệm thuốc, cột C18 và pha động water–acetonitrile là tiêu chuẩn cho nhiều phương pháp theo USP và EP (USP).

Trong hóa sinh và proteomics, sắc kí cột kết hợp với khối phổ (LC–MS/MS) cho phép xác định protein và peptide phức tạp trong mẫu sinh học. Công nghệ HPLC–MS ngày càng phổ biến nhờ độ nhạy cao và khả năng phân tích đa phân tử (ACS Publications).

Ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm và môi trường bao gồm phát hiện pesticide, mycotoxin, hợp chất gây ô nhiễm hữu cơ bền (POPs). Flash chromatography còn hỗ trợ thành phần chiết xuất thiên nhiên để phân lập tinh dầu, alkaloid và flavonoid.

Khắc phục sự cố thường gặp

• Peak broadening: kiểm tra kích thước hạt, áp suất dòng, điều chỉnh tốc độ gradient.
• Peak tailing: làm sạch cột, bổ sung acid/base trong pha động, thay pha tĩnh nếu bị hư hại.
• Backpressure tăng: lọc mẫu kỹ, làm sạch pha tĩnh, xả bọt khí trong bơm.

Kiểm tra định kỳ áp suất bơm, tình trạng pha tĩnh và detector giúp giảm thời gian bảo trì. Việc lưu lại điều kiện chạy và kết quả phân tích hỗ trợ chẩn đoán nhanh nguyên nhân sự cố.

Xu hướng phát triển và tự động hóa

Tích hợp hệ thống autosampler, autosampler vial, và phần mềm điều khiển gradient tự động cho phép thiết lập phương pháp một lần và chạy tự động hàng chục mẫu liên tục. Công nghệ monolith và core–shell giúp giảm backpressure và tăng tốc độ phân tách (Thermo Fisher Scientific).

Kết hợp HPLC với MS/MS, MS^n hoặc Orbitrap nâng cao độ nhạy và selectivity, phù hợp với phân tích trace và xác định cấu trúc tinh vi. Microflow LC và nanoLC mở rộng ứng dụng cho proteomics định lượng thấp (IUPAC).

• Sử dụng AI và machine learning để dự đoán điều kiện phân tách tối ưu.
• Phát triển pha tĩnh mới bền hóa học và cơ học, thích hợp cho pH cực trị.
• Ứng dụng công nghệ 3D printing để chế tạo cột tùy biến với địa hình vi mao quản.

Tài liệu tham khảo

• Snyder, L. R., Kirkland, J. J., & Dolan, J. W. (2011). Introduction to Modern Liquid Chromatography. Wiley.
• Harris, D. C. (2015). Quantitative Chemical Analysis. W. H. Freeman.
• International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC). “Chromatography Nomenclature.” Truy cập tại iupac.org.
• Thermo Fisher Scientific. “Principles of HPLC.” Truy cập tại thermofisher.com.
• ChromAcademy. “Basics of Column Chromatography.” Truy cập tại chromacademy.com.